气相色谱法快速测量米粉中香兰素和乙基香兰素含量（一）

米粉，气相以大米为主要原料，色谱速测素和素含经浸泡、法快粉中蒸煮、量米量压条等工序制成的香兰香兰条状、丝状米制品，乙基深受广大消费者的气相喜爱，历史比较悠久，色谱速测素和素含据传是法快粉中古代中国五胡乱华时期北方民众避居南方而产生的食品。婴幼儿米粉（又称婴幼儿米糊），量米量以大米、香兰香兰小米为主要原料，乙基添加适量的气相营养强化剂，加工制成的色谱速测素和素含适合6个月以上婴幼儿的补充营养的辅助食品，是法快粉中婴幼儿谷类辅助食品之一，品种繁多，是不少婴幼儿比较喜爱和家庭常见的食物。作为人工合成的第一种香料，天然的香兰素产量较低，且价格较贵，随着科技的不断进步，香兰素的产量每年都在增加，2019年全球香兰素产量约2万吨，其中中国约占70%，中国是目前世界上香兰素和乙基香兰素最大的生产国和消费国，作为在食品生产中广泛使用的可食用香料，香兰素和乙基香兰素主要作用是使食品产生独特的奶香味及香子兰的气味，增进人的食欲，提高食品质量；恢复食品香味，强化特征味道；消杀食品中的不良味道。在国家标准GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，0～6个月的婴幼儿配方食品不得添加任何食品用香料，香兰素在婴幼儿谷类辅助食品中可以使用，但最大使用量不得超过7mg/100g，美国食品香料与萃取物制造者协会（FEMA）建议软饮料中的香兰素的用量6.3mg/100g，目前对香兰素和乙基香兰素没有相应的国家检测标准和方法，香兰素和乙基香兰素虽然是很安全的食品添加剂，但加了超量香兰素的米粉可能会影响婴幼儿对此类食品的依赖性，而且大剂量摄入香兰素可能致人体肝肾损害，尤其是婴幼儿。米粉中，尤其是婴幼儿米粉中，不少生产企业为了产品有更好的口味，在产品中添加了香兰素，生产企业能否严格按标准规定要求使用对整个食品行业的发展，也和我们每个人的身体健康密不可分。根据相关报道和文献资料，目前对食品中香兰素和乙基香兰素检测液相法或液质法较多，而气相法较少，液相法或液质法中处理样品所用的有机试剂较多是已烷或乙腈，本方法主要探讨利用安捷伦7890B气相色谱FID检测器，用乙醇（相较于已烷或乙腈，更安全）为提取液，已酸乙酯作为内标，优化色谱条件，实现了香兰素和乙基香兰素两种物质的分离，方法灵敏准确、操作简单，是定量检测米粉中香兰素和乙基香兰素含量的理想方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪：安捷伦7890B（配有FID检测器，7693液体自动进样器和150位进样盘）；旋涡混合器XW-80A：上海弛唐电子有限公司；旋涡混合器XW-80A：赛默飞世尔；分析天平ME204T/02：梅特勒仪器有限公司。

香兰素（C₈H₈O₃，CAS：121-33-5，色谱纯）、乙基香兰素（C₉H₁₀O₃，CAS：121-32-4，色谱纯）：上海易恩化学技术有限公司；已酸乙酯（C₈H₁₆O₂，CAS：125-66-0，色谱纯）、乙醇（C₂H₄O，CAS号：64-17-5.色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；有机相相针式滤器（尼龙）：100只/罐，13mm，0.22μm，上海安谱实验科技有限公司。

1.2 色谱条件

检测器温度：300℃，进样口温度：270℃；进样量1µL（衬管为5190～2295），分流进样，分流比5∶1，色谱柱：DB-1（15m×0.32mm×5.0µm）；柱箱：90℃（2min）-10℃/min升至220℃（5min），后运行280℃（1min）。

1.3 标准溶液

1.3.1 已酸乙酯、香兰素、乙基香兰素标准溶液储备液（1000µg/mL）

分别准确称取0.1g已酸乙酯、香兰素、乙基香兰素至100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀，0～4℃低温冰箱密封保存。

1.3.2 分别吸取香兰素、乙基香兰素标准储备溶液0.05、0.10、0.25、0.40、0.50mL

分别准确称取于10mL的容量瓶中，加入0.2mL已酸乙酯，以乙醇定容至刻度，依次配制成香兰素、乙基香兰素标准溶液为5、10、25、40、50µg/mL系列混合系列内标标准工作液，现用现配。

1.4 试样制备及测定

称取混合均匀的米粉样品2g（精确至0.001g）于15mL离心管中，加入10mL乙醇，加入0.2mL已酸乙酯标准溶液储备液，涡旋混匀2min，10000r/min离心5min，再用0.22µm气相滤头过滤于进样瓶中，待测。同时做空白试验。

2 结果和分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 气相色谱条件的选择

气相色谱条件的选择和优化主要涉及到仪器的检测器、进样口和毛细管柱及其升温程序、柱流速，目前实验室常用的安捷伦气相检测器有4种分别是FPD、NPD、ECD、FID、FPD、NPD检测器主要检测农药残留，故未考虑，经过试验和查找相关资料，ECD检测器对香兰素、乙基香兰素的响应值很低，基本不出峰，而FID检测器对香兰素、乙基香兰素响应值很高，选择检测器温度250℃、300℃、320℃和选择进样口温度200℃、250℃、270℃进行多次试验，发现检测器温度300℃和进样口温度270℃时三种物质峰形最好且分离效果最好。

本试验主要考察了毛细管柱DB-FAAP（50m×0.32mm×0.50µm）、DB-1（15m×0.32mm×5.0µm）、HP-1（25m×0.32mm×0.25μm）、HP-5（30m×0.25mm×0.25μm）、DB-1701（30m×0.32mm×0.25μm等毛细管柱的分离效果，尤其对DB-1（15m×0.32mm×5.0µm）、DB-1（30m×0.25mm×0.25µm）、HP-1（25m×0.32mm×0.25μm）三种规格的毛细管柱进行多次实验验证，发现毛细管柱的膜厚对峰形有较大的影响，5.0µm膜厚的峰形更尖锐对称且分离时间更短，结果表明选择极性柱和中极柱时，三种组分基本不出峰或峰形很差，针对DB-1（15m×0.32mm×5.0µm）毛细管柱进行程序升温和恒温设置，以及不同柱流速下的出峰情况进行多次验证，恒温120℃、180℃、210℃、时间30min以及程序升温90℃（2min）-10℃/min升至220℃（5min）等条件下和柱流速为0.5、1.0、1.5、2.0mL/min几种情况下的标样的色谱图，发现恒温条件下三种物质的分离不是太好，且需要较长时间，而程序升温明显提高色谱柱的分离度，当柱流速大于1.5mL/min，由于毛细柱为15m，溶液出峰时间过于靠前，峰形不太好，当柱流速小于0.5mL/min，就降低了工作效率，出峰时间过长，所以最终选择色谱条件为1.2.1。

2.1.2 内标物的选择

内标法与外标法相比，主要优点是消减了仪器进样过程中进样体积的变化对检测结果的影响，能提高分析结果的准确度，选择实验室常用的有机试剂乙腈、甲醇、已酸乙酯作为内标物，经过多次实验，发现已酸乙酯为内标物最好，20µg/mL已酸乙酯时，峰面积为83.6；25µg/mL香兰素峰面积为119.6；25µg/mL乙基香兰素峰面积为107.8，而且三者的化学性质相似，三者互溶，已酸乙酯是米粉中不可能存在的物质，内标物已酸乙酯的量接近于被测组分香兰素、乙基香兰素，但不会发生化学反应，所以最终选择已酸乙酯作为内标物。在1.2条件下25µg/mL香兰素、乙基香兰素混合内标液中，已酸乙酯的塔板数为128499，分离度为34.54，香兰素的塔板数为268807，分离度为54.37，乙基香兰素的塔板数为236058，分离度为8.63，三者完全分离且效果很好，能满足标准规定的要求，三组分在20min内完成分离，分离效果最理想。

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